Stephanus wurde 254 zum römischen Bischof gewählt. Zwischen den Christenverfolgungen von Kaiser Decius und denen von Kaiser Valerianus war seine Amtszeit nicht von äußerem Druck belastet. Die Legende berichtet, dass Stephanus unermüdlich Heiden bekehrte und christliche Märtyrer bestattete. Ein blindes Mädchen namens Lucilla soll er geheilt und dann die ganze Familie getauft haben.
In heftigen Auseinandersetzungen mit Cyprian von Karthago stärkte Stephanus die Zentralgewalt der römischen Kirche. Die Kirchen in Nordafrika, Syrien und Kleinasien vertraten zusammen mit Cyprian, dass eine Taufe nur innerhalb der Kirche gespendet werden könne, eine von Häretikern vollzogene Taufe ungültig sei; bekehrte Ketzer müssten sich deshalb einer erneuten, gültigen Taufe unterziehen. Stephanus beharrte jedoch darauf, dass Wiedertaufe ausgeschlossen sei und Häretiker lediglich der Lossprechung durch Handauflegung bedürfen. Die Cyprians Position stützenden Beschlüsse zweier nordafrikanischen Synode n lehnte Stephanus ab und drohte den afrikanischen und kleinasiatischen Gemeinden mit Ausschluss aus der Kirchengemeinschaft - nach mancher Auffassung vollzog er sie auch. Vermittlungsversuche durch Dionysius von Alexandria blieben erfolglos; es drohte der Bruch zwischen Rom und großen Teilen der Kirche, bis Stephanus - und ein Jahr später auch Cyprian - starb, wodurch die spannungsgeladene Situation unter Stephanus' Nachfolger Sixtus II. entschärft wurde.
Sixtus legte Wert auf die besondere Stellung Roms, gegen gallische und spanische Bischöfe ergriff er auf dieser Grundlage Disziplinarmaßnahmen.
Kaiser Valerianus ließ - nach der legendären Erzählung, die Stephanus auf Grund einer Verwechslung zum Märtyrer macht - Stephanus suchen, ihn gefangen nehmen und zum Marstempel - heute Ruine im Forum des Augustus - führen, wo er opfern sollte. Stephanus betete, woraufhin Stücke des Tempels herunterfielen und das Volk floh; Stephanus ging frei zur Begräbnisstätte der Lucina. Dort fanden ihn die Häscher und enthaupteten ihn am Altar.
Stephanus wurde in der Callistus-Katakomben in Rom bestattet. Die Reliquie von Stephanus' Kopf wird in Speyer verehrt.
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